FASE 0. PREPARACIÓN

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantos es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donante de yemas, durante un período que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas.

En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.

Para realizar un cultivo in vitro es necesario seleccionar el material vegetal a utilizar y que se debe esterilizar, ya que en todo el proceso es necesario mantener unas condiciones de asepsia y esterilidad. Antes de esto, se debe preparar el medio de cultivo, que también debe estar esterilizado. Los medios de cultivo son una parte muy importante en el cultivo in vitro, ya que son necesarios para el crecimiento y desarrollo.

Podemos definir "medio de cultivo" como una solución donde están disueltos los

macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg) y los micronutrientes (Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co) necesarios para ese crecimiento y desarrollo, que además se puede complementar con otros compuestos como sacarosa (fuente de carbono),aminoácidos, vitaminas y hormonas (reguladores del crecimiento como auxinas, citoquininas).

El medio de cultivo puede ser líquido (condiciones hidropónicas) o sólido (lleva una parte de agar para gelificar). Aunque existen varios medios de cultivo (SH, Shenk y Hildebrandt 1972; B5, Gamborg, Miller y Ojima 1968; White 1963), el más utilizado es el de Murashige & Skoog 1962 (MS), que se puede comprar ya hecho.

Es necesario ajustar el pH del medio hasta 5,7. Si el medio es sólido se añaden unos 7,5 g de agar. El medio se esteriliza en el autoclave y se reparte en los recipientes que se utilizarán para el cultivo in vitro (placas petri, tubos de ensayo grandes, botes de vidrio, etc.).